D. Yu.
ເຊື້ອເຫັດ phytopathogenic Colletotrichum coccodes ເຮັດໃຫ້ເກີດພະຍາດອັນຕະລາຍຂອງມັນຕົ້ນແລະຫມາກເລັ່ນ, ເອີ້ນວ່າ anthracnose ແລະຈຸດສີດໍາຫົວ. ໂດຍອີງໃສ່ຄຸນລັກສະນະທາງ morphological, ພວກມັນມັກຈະເປັນການຍາກທີ່ຈະຈໍາແນກຈາກພະຍາດທີ່ເກີດຈາກຈຸລິນຊີອື່ນໆ; ໃນຫມາກໄມ້ຫມາກເລັ່ນສີຂຽວ, ພະຍາດສາມາດບໍ່ມີອາການ, ປາກົດຢູ່ໃນຫມາກໄມ້ສີແດງທີ່ສຸກແລ້ວ. ສໍາລັບການວິນິດໄສໄວແລະຖືກຕ້ອງຂອງເຊື້ອພະຍາດ, ລະບົບການທົດສອບ PCR ໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງແມ່ນສະຫນອງໃຫ້. ເພື່ອພັດທະນາລະບົບການທົດສອບ, ລໍາດັບ nucleotide ຂອງ glycerol triphosphate dehydrogenase gene ໄດ້ຖືກກໍານົດສໍາລັບ 45 ສາຍພັນ C. coccodes ທີ່ໂດດດ່ຽວຈາກຫົວມັນຕົ້ນໃນພາກພື້ນຕ່າງໆຂອງລັດເຊຍ.
ອີງຕາມຜົນໄດ້ຮັບທີ່ໄດ້ຮັບແລະການວິເຄາະລໍາດັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນຂອງຊະນິດອື່ນໆທີ່ມີຢູ່ໃນຖານຂໍ້ມູນ GenBank, primers ສະເພາະຊະນິດແລະ probe ໄດ້ຖືກອອກແບບສໍາລັບ C. coccodes. ເພື່ອກວດເບິ່ງຄວາມສະເພາະຂອງລະບົບການທົດສອບທີ່ສ້າງຂຶ້ນ, PCR ໄດ້ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍ DNA ທີ່ໂດດດ່ຽວຈາກວັດທະນະທໍາອັນບໍລິສຸດຂອງ 15 ຊະນິດຂອງເຊື້ອກາຝາກແລະເຊື້ອເຫັດ saprotrophic ທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຕົ້ນຫມາກເລັ່ນແລະມັນຕົ້ນ (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani. , Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). ການປະກົດຕົວຂອງ Colletotrichum coccodes DNA ໄດ້ຖືກກວດພົບໃນຮອບວຽນຂອງ 20-27, ໃນຂະນະທີ່ຊະນິດອື່ນໆໄດ້ຖືກກວດພົບຫຼັງຈາກຮອບວຽນ 40 ຫຼືບໍ່ຖືກກວດພົບ. ລະບົບການທົດສອບອະນຸຍາດໃຫ້ທ່ານສາມາດກວດສອບ C. coccodes ຄວາມເຂັ້ມແຂງ DNA ເກີນ 0.01 ng/mm3 ໃນການປະສົມ PCR ການວິເຄາະ. ການນໍາໃຊ້ລະບົບການທົດສອບທີ່ພັດທະນາ, ການປະກົດຕົວຂອງ C. coccodes ໄດ້ຖືກສຶກສາຢູ່ໃນໃບຫມາກເລັ່ນທີ່ມີອາການຂອງພະຍາດເຊື້ອເຫັດແລະໃນຫົວມັນຕົ້ນບໍ່ມີອາການພາຍນອກຂອງພະຍາດ. ໃບທີ່ມີອາການຂອງເຊື້ອເຫັດໄດ້ຖືກເກັບມາຈາກສອງທົ່ງນາທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນພາກພື້ນ Krasnodar, ຫົວ - ຈາກທົ່ງນາໃນເຂດ Kostroma, Moscow, Kaluga, ແລະ Nizhny Novgorod. ໃນພາກພື້ນ Krasnodar, ໃບຫມາກເລັ່ນຫນຶ່ງໃບທີ່ມີ C. coccodes DNA ໄດ້ຖືກພົບເຫັນ; ການມີ DNA ທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຂອງເຊື້ອພະຍາດນີ້ໄດ້ຖືກກວດພົບຢູ່ໃນ 5 ຕົວຢ່າງຂອງຫົວທີ່ປູກຢູ່ໃນເຂດ Kostroma, Moscow, ແລະ Kaluga.
ການນໍາສະເຫນີ
ເຊື້ອລາຂອງສະກຸນ Colletotrichum ແມ່ນ phytopathogens ອັນຕະລາຍທີ່ທໍາຮ້າຍເມັດພືດ, ຜັກ, ພືດສະຫມຸນໄພ, ແລະຫມາກໄມ້ຫຼາຍປີແລະພືດຫມາກມີເນື້ອ. ຫນຶ່ງໃນຊະນິດພັນທຸກໍາຂອງສະກຸນນີ້, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, ເປັນຕົວແທນສາເຫດຂອງ anthracnose ແລະຈຸດສີດໍາຂອງມັນຕົ້ນແລະຫມາກເລັ່ນ, ແລະເຮັດໃຫ້ເກີດພະຍາດຂອງພືດອື່ນໆຈໍານວນຫນຶ່ງຂອງຄອບຄົວ nightshade, ລວມທັງ. ຫຍ້າ (Dillard, 1992). C. coccodes ຕິດເຊື້ອທຸກພາກສ່ວນໃຕ້ດິນຂອງພືດ, ກົກໃບ, ໃບ ແລະ ໝາກ (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). ໃນຜິວຫນັງຂອງຫົວມັນຕົ້ນທີ່ຕິດເຊື້ອ, ການພັດທະນາຂອງຈຸດສີຂີ້ເຖົ່າທີ່ມີຂອບທີ່ຖືກກໍານົດຢ່າງຈະແຈ້ງແມ່ນສັງເກດເຫັນ, ເຊິ່ງຈຸດສີດໍາຂອງ sporulation ແລະ microsclerotia ແມ່ນເຫັນໄດ້ຊັດເຈນ. ໃນລະຫວ່າງການເກັບຮັກສາ, ບາດແຜທີ່ມີເນື້ອໃນອ່ອນໆອາດຈະເກີດຂື້ນໃນເນື້ອເຍື່ອຫົວ, i.e. ພະຍາດດັ່ງກ່າວເຂົ້າສູ່ໄລຍະ anthracnose, ເຊິ່ງ, ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ແມ່ນຫາຍາກທີ່ສຸດ.
ໃນເວລາດຽວກັນ, ອາການຂອງໂຣກ anthracnose (ບາດແຜທີ່ປົກຄຸມດ້ວຍຜິວ ໜັງ ທີ່ມີຈຸດສີ ດຳ ນ້ອຍໆ) ແມ່ນປົກກະຕິໃນ ໝາກ ເລັ່ນ. ໃນໃບ, ອາການຂອງບາດແຜຂອງ C. coccodes ປາກົດເປັນຈຸດສີນ້ໍາຕານເຂັ້ມ, ປົກກະຕິແລ້ວມີຊາຍແດນຕິດກັບເນື້ອເຍື່ອສີເຫຼືອງ (Johnson, 1994).
ການພັດທະນາຈຸດດ່າງ ດຳ ໃນຫົວມັນເຮັດໃຫ້ຮູບລັກສະນະຂອງມັນ, ເຊິ່ງຈະແຈ້ງໂດຍສະເພາະໃນເວລາທີ່ຂາຍມັນຕົ້ນທີ່ມີຜິວ ໜັງ ສີແດງ. ການແຍກປອກເປືອກນໍາໄປສູ່ການລະເຫີຍເກີນແລະການສູນເສຍການເກັບຮັກສາເພີ່ມຂຶ້ນ (Hunger and McIntyre, 1979). ຄວາມເສຍຫາຍຕໍ່ອະໄວຍະວະຂອງພືດອື່ນໆນໍາໄປສູ່ການສູນເສຍຜົນຜະລິດ, ເຊິ່ງໄດ້ສັງເກດເຫັນທັງໃນສະພາບພື້ນທີ່ເປີດແລະປິດ (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). ພະຍາດທີ່ເກີດຈາກ C. coccodes ແມ່ນພົບເລື້ອຍໃນເກືອບທຸກຂົງເຂດທີ່ຜະລິດມັນຕົ້ນຂອງໂລກ, ລວມທັງລັດເຊຍ (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). ການຄວບຄຸມພະຍາດເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກເນື່ອງຈາກປະສິດທິພາບບໍ່ພຽງພໍຂອງຢາຂ້າເຊື້ອລາທີ່ມີຢູ່ແລ້ວຕໍ່ກັບ C. coccodes ແລະການຂາດແນວພັນທີ່ທົນທານຕໍ່ (Read and Hide, 1995).
inoculum ຂອງ C. coccodes ສາມາດຮັກສາໄວ້ຢູ່ໃນຫົວຂອງເມັດ (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), ແກ່ນຫມາກເລັ່ນ (Ben-Daniel et al., 2010), ແລະຢູ່ລອດເປັນເວລາດົນນານໃນດິນແລະ. ກ່ຽວກັບເສດພືດ (Dillard, 1990; Dillard and Cobb, 1993) ແລະໃນຫຍ້າ (Raid and Pennypacker, 1987). ວຽກງານຂອງຜູ້ຂຽນຈໍານວນຫນຶ່ງ (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການພັດທະນາຂອງພະຍາດກ່ຽວກັບມັນຕົ້ນແລະຫມາກເລັ່ນສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຂຶ້ນກັບການປະກົດຕົວ. ຂອງ inoculum ໃນວັດສະດຸແກ່ນແລະໃນດິນ. ດັ່ງນັ້ນ, ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການສູນເສຍຈາກພະຍາດ, ມັນຈໍາເປັນຕ້ອງໄດ້ວິນິດໄສ (ລວມທັງປະລິມານ) ການແຜ່ກະຈາຍເຊື້ອເຫັດໃນວັດສະດຸແກ່ນ, ໃນດິນ, ໃນຫົວເມັດມັນຕົ້ນແລະແກ່ນຫມາກເລັ່ນທີ່ເກັບຮັກສາໄວ້ສໍາລັບການເກັບຮັກສາ. ການວິນິດໄສ morphological ໃນດິນແລະວັດສະດຸຂອງພືດສາມາດປະຕິບັດໄດ້ພຽງແຕ່ໂດຍການມີ microsclerotia, ເຊິ່ງ, ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຍັງພົບເຫັນຢູ່ໃນປະເພດອື່ນໆຂອງເຊື້ອເຫັດ.
ອາການຂອງຫົວແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບເກັດເງິນ, ເຊິ່ງເກີດຈາກເຊື້ອເຫັດ Helminthosporium solani. ການແຍກຕົວຂອງ Colletotrichum coccodes ແລະ Helminthosporium solani ເຂົ້າໄປໃນວັດທະນະທໍາອັນບໍລິສຸດແມ່ນຂ້ອນຂ້າງມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກແລະໃຊ້ເວລາດົນເນື່ອງຈາກການຂະຫຍາຍຕົວຊ້າໃນຂະຫນາດກາງຂອງທາດອາຫານ. ເພື່ອກໍານົດໄວ coccodes Colletotrichum, ມັນຈໍາເປັນຕ້ອງໃຊ້ວິທີການວິນິດໄສເຄື່ອງມື. ວິທີທີ່ສະດວກທີ່ສຸດແມ່ນປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ polymerase (PCR) ແລະການດັດແປງຂອງມັນ - PCR ໃນເວລາຈິງ. ໃນປັດຈຸບັນ, ໃນເອີຣົບແລະອາເມລິກາ, ລະບົບການທົດສອບທີ່ພັດທະນາໂດຍນັກຄົ້ນຄວ້າພາສາອັງກິດ (Cullen et al., 2002) ສໍາລັບພາກພື້ນ ITS1 ຂອງ rDNA ແມ່ນຖືກນໍາໃຊ້. ການນໍາໃຊ້ຂອງມັນຍັງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນຜົນໄດ້ຮັບທີ່ດີໃນການວິເຄາະການໂດດດ່ຽວຂອງລັດເຊຍ (Belov et al, 2018). ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, C. coccodes ແມ່ນມີຄວາມປ່ຽນແປງສູງແລະການກວດພົບຂອງມັນໂດຍໃຊ້ລໍາດັບ DNA ດຽວອາດຈະນໍາໄປສູ່ຜົນໄດ້ຮັບທາງລົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ. ສໍາລັບຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືໃນການວິນິດໄສຫຼາຍກວ່າເກົ່າ, ຕ້ອງມີການວິເຄາະລໍາດັບ DNA ສະເພາະຫຼາຍຊະນິດ, ແລະດັ່ງນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາລະບົບການທົດສອບຕົ້ນສະບັບທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາກໍານົດ C. coccodes ໂດຍລໍາດັບຂອງ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene.
ວັດສະດຸແລະວິທີການ
ເພື່ອປະເມີນປະສິດທິຜົນແລະຄວາມສະເພາະຂອງລະບົບການທົດສອບທີ່ສ້າງຂຶ້ນ, ວັດທະນະທໍາອັນບໍລິສຸດຂອງເຊື້ອເຫັດ 15 ຊະນິດທີ່ແຍກອອກໂດຍຜູ້ຂຽນຈາກຕົວຢ່າງທີ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຂອງໃບຫມາກເລັ່ນແລະຫມາກໄມ້ແລະຫົວມັນຕົ້ນ (ຕາຕະລາງ 1). ສໍາລັບການໂດດດ່ຽວ, ອະໄວຍະວະຂອງພືດທີ່ມີອາການຕິດເຊື້ອເຫັດໄດ້ຖືກປະຕິບັດ, ບໍ່ເກີນຫນຶ່ງອະໄວຍະວະຕໍ່ພຸ່ມໄມ້.
ພາກສ່ວນຂອງຫົວທີ່ມີປອກເປືອກ, ຫມາກເລັ່ນ, ຫຼືໃບທີ່ຖືກກະທົບໄດ້ຖືກວາງໄວ້ພາຍໃຕ້ກ້ອງຈຸລະທັດ, ຫຼັງຈາກນັ້ນ, mycelium, spores ຫຼືຊິ້ນສ່ວນຂອງເນື້ອເຍື່ອໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາ agar medium (wort agar) ໃນຖ້ວຍ Petri. ດ້ວຍເຂັມຂັດທີ່ແຫຼມຄົມຊັດ. Isolates ໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນ agar slants ໃນທໍ່ທົດລອງທີ່ 4 ° C.
ຕົວຢ່າງຂອງໃບຫມາກເລັ່ນທີ່ມີຈຸດປະສົງໃນການວິເຄາະອາການຂອງພະຍາດ fungal ທັນທີຫຼັງຈາກການລວບລວມ (ໃນພາກສະຫນາມ) ໄດ້ຖືກຈັດໃສ່ໃນ 70% ເຫຼົ້າ ethyl ທີ່ເຂົາເຈົ້າໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ຈົນກ່ວາການສະກັດເອົາ DNA. ຫົວມັນຕົ້ນຖືກສົ່ງໄປຫ້ອງທົດລອງ, ປອກເປືອກ (ຊິ້ນ 2 × 1 ຊມ) ແລະແຊ່ແຂງຢູ່ທີ່ -20 ອົງສາ. ພວກມັນຖືກເກັບໄວ້ແຊ່ແຂງຈົນກ່ວາການສະກັດເອົາ DNA.
ວັດທະນະທໍາອັນບໍລິສຸດຂອງເຊື້ອເຫັດສໍາລັບການສະກັດ DNA ໄດ້ຖືກປູກຢູ່ໃນຂະຫນາດກາງຂອງຖົ່ວແຫຼວ. mycelium ເຊື້ອເຫັດໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກຈາກຂະຫນາດກາງຂອງແຫຼວ, ຕາກແດດໃຫ້ແຫ້ງໃນເຈ້ຍການກັ່ນຕອງ, ແຊ່ແຂງໃນໄນໂຕຣເຈນຂອງແຫຼວ, ເປັນ homogenized, incubated ໃນ CTAB buffer, ຊໍາລະດ້ວຍ chloroform, precipitated ກັບປະສົມຂອງ isopropanol ແລະ 0.5 M potassium acetate, ແລະລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍເຫຼົ້າ 2%. . DNA ຜົນໄດ້ຮັບຖືກລະລາຍໃນນ້ໍາ deionized ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -70 ° C (Kutuzova et al., 20). ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ DNA ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍໃຊ້ຊຸດການວັດແທກ HS DNA ສໍາລັບ DNA ທີ່ມີສາຍສອງໃນ Qubit 2017 (Qiagen, ເຢຍລະມັນ). ຕົວຢ່າງທີ່ເກັບຮັກສາໄວ້ແລະແຊ່ແຂງແມ່ນດິນໃນທາດໄນໂຕຣເຈນຂອງແຫຼວ, ຫຼັງຈາກນັ້ນ DNA ຖືກແຍກອອກຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ (ສໍາລັບ mycelium ຂອງເຊື້ອເຫັດທີ່ບໍລິສຸດ).
ຕາຕະລາງ 1. ແຫຼ່ງກຳເນີດຂອງເຊື້ອເຫັດທີ່ໃຊ້ໃນວຽກງານນີ້
ຊື່ເຫັດ | ພືດ, ອະໄວຍະວະ | ສະຖານທີ່ເລືອກ |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | ຫົວມັນຕົ້ນ | ພາກພື້ນ Kostroma, ຫົວມັນຕົ້ນຂອງການຜະລິດພາກສະຫນາມທີ 1, ແນວພັນສີແດງ Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | ໃບມັນຕົ້ນ | ຜູ້ຕາງໜ້າ Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | ຫົວມັນຕົ້ນ | ພາກພື້ນ Magadan, pos. ເຕັນ, ຫົວມັນຕົ້ນ |
Cladosporium fulvum | ໃບຫມາກເລັ່ນ | ພາກພື້ນ Moscow, ຫມາກເລັ່ນຂະຫນາດໃຫຍ່ |
Alternaria tomatophila | ໝາກເລັ່ນ | ໂອນໂດຍພະນັກງານຂອງຫ້ອງທົດລອງຂອງ mycology ແລະ phytopathology ຂອງສະຖາບັນຄົ້ນຄ້ວາທັງຫມົດລັດເຊຍຂອງການປົກປ້ອງພືດ. |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | ໝາກເລັ່ນ | ເຂດ Krasnodar, ເມືອງ Crimean, ແນວພັນ Slivka |
oxusporum Fusarium | ຮາກ wheat | ພາກພື້ນ Moscow |
PCR ໄດ້ດໍາເນີນການໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງຂະຫຍາຍສຽງ DTprime (DNA-Technology). ເພື່ອປະຕິບັດ PCR, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ primer ຕົ້ນສະບັບ ແລະເຄື່ອງສຳຫຼວດພື້ນທີ່ສະເພາະຂອງ glycerol triphosphate dehydrogenase gene: forward primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCACGCA, reverse primer Coc280gdr – TACTTGAGCATGTAGGCCTGATGGA, –cCTAM )- GGGCTGCTGCCG(p). primers ຂະຫຍາຍພື້ນທີ່ 1 bp.
ປະຕິກິລິຍາກ່ຽວຂ້ອງກັບ 50 ng ຂອງ DNA ທັງຫມົດ (ເມື່ອວິເຄາະໃບແລະຫົວ) ແລະ 10 ng (ເມື່ອວິເຄາະ DNA ຈາກເຊື້ອເຫັດອັນບໍລິສຸດ). ປະສົມປະຕິກິລິຍາ (35 μl) ຖືກແບ່ງອອກເປັນສອງສ່ວນໂດຍຊັ້ນ paraffin: ຊັ້ນຕ່ໍາ (20 μl) ມີ 2 μlຂອງ 10 × buffer ປະຕິກິລິຍາ (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25; mM MgCl2; ເທິງສຸດມີ 0.1 μlຂອງ 20 × PCR buffer ແລະ 0.5 ຫນ່ວຍຂອງ Taq polymerase.
ການແຍກສ່ວນປະສົມກັບ paraffin ຊ່ວຍໃຫ້ທໍ່ສາມາດເກັບຮັກສາໄວ້ເປັນເວລາດົນນານຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມ 5 ° C ແລະເພື່ອຮັບປະກັນການເລີ່ມຕົ້ນຂອງ PCR ຮ້ອນຫຼັງຈາກພວກມັນໄດ້ຮັບຄວາມຮ້ອນສໍາລັບ 10 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມສູງກວ່າ 80 ° C. PCR ຖືກປະຕິບັດຕາມໂຄງການດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: 94.0 ° C - 90 s (1 ວົງຈອນ); 94.0°C – 30 ວິ; 64.0°C – 15 s (5 ຮອບ); 94.0°C – 10 ວິ; 64.0°C – 15 s (45 ຮອບ); 10.0°C – ການເກັບຮັກສາ.
ຜົນໄດ້ຮັບແລະການສົນທະນາ
ລໍາດັບຂອງ glycerol triphosphate dehydrogenase gene ໄດ້ຖືກກໍານົດຢູ່ໃນ 45 ສາຍພັນທີ່ແຍກອອກຈາກໃບ, ລໍາຕົ້ນ, ຫົວມັນຕົ້ນແລະຫມາກເລັ່ນ (Kutuzova, 2018) ໃນຂົງເຂດຕ່າງໆຂອງລັດເຊຍ. ລໍາດັບການສຶກສາຂອງສາຍພັນທັງຫມົດໄດ້ຖືກແບ່ງອອກເປັນ 2 ກຸ່ມ, ແຕກຕ່າງກັນໃນສອງ nucleotides. ລໍາດັບ nucleotide ຂອງຕົວແທນຂອງທັງສອງກຸ່ມໄດ້ຖືກຝາກໄວ້ໃນ GenBank ພາຍໃຕ້ຕົວເລກ KY496634 ແລະ KY496635.
primers coc70gdf, coc280gdr ແລະ cocgdz probe ທີ່ສ້າງຂຶ້ນບົນພື້ນຖານຂອງພວກມັນໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍໃຊ້ໂຄງການ BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) ໃນທຸກ glycerol triphosphate dehydrogenase gene sequences ທີ່ມີຢູ່ໃນຖານຂໍ້ມູນ GenBank ຈາກຊະນິດຂອງ genus Colletotrichum ແລະສິ່ງມີຊີວິດອື່ນໆ.
ບໍ່ພົບພື້ນທີ່ DNA ຂອງສິ່ງມີຊີວິດອື່ນໆທີ່ມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນສູງກັບ primers ແລະ probe.
ຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງລະບົບການທົດສອບໄດ້ຖືກທົດສອບໂດຍໃຊ້ຕົວຢ່າງທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ C. coccodes DNA, DNA ຈາກໃບມັນຕົ້ນທີ່ຖືກຜົນກະທົບຈາກໂຣກ anthracnose (ເກັບກໍາໃນ 2017 ໃນ Mari El, Red Scarlett ແນວພັນ), ແລະເປືອກເປືອກຂອງຫົວທີ່ຖືກກະທົບໂດຍຈຸດສີດໍາ (ເກັບກໍາຢູ່ໃນ ພາກພື້ນ Kostroma, ແນວພັນສີແດງ Scarlett, ຕາຕະລາງ 2). ເພື່ອຢືນຢັນການປະກົດຕົວຂອງ DNA ໃນຫົວມັນຕົ້ນແລະໃບ, ເຊື້ອສາຍ C. coccodes ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກພວກມັນເຂົ້າໄປໃນວັດທະນະທໍາທີ່ບໍລິສຸດ.
ຜົນໄດ້ຮັບຂອງການວິເຄາະຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງລະບົບການທົດສອບສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມັນສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະສົບຜົນສໍາເລັດໃນການວິນິດໄສການປະກົດຕົວຂອງ C. coccodes DNA ໃນຕົວຢ່າງຖ້າເນື້ອຫາທັງຫມົດຂອງມັນຢູ່ໃນປະສົມ PCR ແມ່ນຫຼາຍກ່ວາ 0.05 ng. ນີ້ແມ່ນຂ້ອນຂ້າງພຽງພໍສໍາລັບການກວດພົບ, ເນື່ອງຈາກວ່າຫນຶ່ງ sclerotia ປະກອບດ້ວຍໂດຍສະເລ່ຍ 0.131 ng, ແລະຫນຶ່ງ spore - ປະມານ 0.04 ng ຂອງ DNA (Cullen et al., 2002). ລະບົບການທົດສອບທີ່ພັດທະນາໂດຍກຸ່ມພາສາອັງກິດ (Cullen et al., 2002) ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມອ່ອນໄຫວທີ່ຄ້າຍຄືກັນ (threshold cycle 34 ຢູ່ 0.05 ng ຂອງ DNA ແລະ 37 ທີ່ 0.005 ng).
ການວິເຄາະຕົວຢ່າງທໍາມະຊາດທີ່ມີ C. coccodes ໃນທຸກກໍລະນີເຮັດໃຫ້ມັນເປັນໄປໄດ້ທີ່ຈະກວດພົບຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືຂອງມັນຢູ່ໃນຕົວຢ່າງ (ຕາຕະລາງ 2). ວິທີການທີ່ສະເຫນີສໍາລັບການສະກັດເອົາ DNA ຍັງໄດ້ກາຍເປັນການນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະຕົວຢ່າງພືດທໍາມະຊາດ.
ຕາຕະລາງ 2. ການກໍານົດຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງລະບົບການທົດສອບການກໍານົດຕົວຕົນຂອງ Colletotrichum coccodes ທີ່ສະເຫນີສໍາລັບ PCR ໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງ
ອອກກໍາລັງກາຍ | ຈໍານວນ DNA ໃນຕົວຢ່າງ*, ng | ຮອບວຽນ | ການກວດຫາ C. coccodes |
---|---|---|---|
Mycelium ຂອງ Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
ປອກເປືອກ 1 | 50 | 32 | + |
ປອກເປືອກ 2 | 50 | 30 | + |
ປອກເປືອກ 3 | 50 | 31.5 | + |
ໃບມັນຕົ້ນ | 50 | 29.5 | + |
ຫມາຍເຫດ. * ໃນປະສົມຜະລິດຕະພັນ PCR.
ຄວາມສະເພາະຂອງລະບົບການທົດສອບໄດ້ຖືກທົດສອບໃນຕົວຢ່າງ DNA ທີ່ສະກັດມາຈາກເຊື້ອເຫັດ 15 ຊະນິດ. ເຊື້ອເຫັດທັງຫມົດໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍຜູ້ຂຽນຈາກຫມາກໄມ້ແລະໃບຫມາກເລັ່ນທີ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບແລະມີສຸຂະພາບດີ, ແລະຫົວມັນຕົ້ນ; ສາຍພັນໜຶ່ງຖືກແຍກອອກຈາກຮາກສາລີ (ຕາຕະລາງ 1). ໃນບັນດາພວກມັນທີ່ໂດດດ່ຽວຈາກຫນ້າດິນຂອງຫມາກໄມ້, ຍັງມີຊະນິດທີ່ບໍ່ມີເຊື້ອພະຍາດສໍາລັບຫມາກເລັ່ນ (ຕົວຢ່າງເຊັ່ນ Phellinus ferrugineovelutinus).
ການສຶກສາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ C. coccodes DNA ໄດ້ຖືກກວດພົບໃນຮອບວຽນຂອງ 20-27, ໃນຂະນະທີ່ເຊື້ອເຫັດຊະນິດອື່ນໆບໍ່ຖືກກວດພົບຫຼືໃຫ້ສັນຍານຫຼັງຈາກວົງຈອນ 40, ເຊິ່ງສາມາດເປັນຜົນກະທົບຂອງສິ່ງລົບກວນທີ່ບໍ່ສະເພາະ (ຕາຕະລາງ 3).
ຕາຕະລາງ 3. ການທົດສອບລະບົບການທົດສອບກ່ຽວກັບເຫັດຊະນິດຕ່າງໆ
ຊື່ເຫັດ | ຮອບວຽນ |
coccodes Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. coccodes 2 | 22.6 |
C. coccodes 3 | 23 |
C. coccodes 4 | 22 |
oxusporum Fusarium | > 40 |
F. verticillium | > 40 |
ໂຣກ Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. ໝາກເລັ່ນ | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium NS. | > 40 |
ຫມາຍເຫດ. * ຈໍານວນ DNA ໃນຕົວຢ່າງທັງຫມົດແມ່ນ 10 ng.
ລະບົບການທົດສອບທີ່ພັດທະນາໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດ C. coccodes ໃນຕົວຢ່າງຂອງໃບຫມາກເລັ່ນທີ່ມີອາການຂອງຄວາມເສຍຫາຍຈາກເຊື້ອພະຍາດ necrotrophic ແລະຫົວມັນຕົ້ນ, ແກ່ນໂດຍບໍ່ມີອາການສັງເກດເຫັນ. ສໍາລັບການສຶກສາ, ຫົວແກ່ນຂອງແນວພັນທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ປູກຢູ່ໃນເຂດ Kostroma, Moscow, Kaluga, ແລະ Nizhny Novgorod ໄດ້ຖືກປະຕິບັດ. ການປະກົດຕົວຂອງ C. coccodes DNA ໄດ້ຖືກພິຈາລະນາທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ໃນຕົວຢ່າງທີ່ວົງຈອນເກນບໍ່ເກີນ 35. ຄ່າເກນນີ້ຖືກເລືອກໂດຍອີງໃສ່ການກວດສອບທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຂອງ 0.05 ng ຂອງ C. coccodes DNA (ຮອບວຽນເກນ 33.5, ຕາຕະລາງ 2) ແລະ. ຄວາມຈິງທີ່ວ່າເມື່ອຢູ່ໃນເກນຮອບວຽນເກີນ 40, DNA ທີ່ບໍ່ສະເພາະຂອງບາງຊະນິດເຊື້ອເຫັດອື່ນໆໄດ້ຖືກວິນິດໄສ. ດ້ວຍວິທີການນີ້, ການປະກົດຕົວທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຂອງ C. coccodes DNA ໄດ້ຖືກກວດພົບຢູ່ໃນ 5 ຕົວຢ່າງຂອງຫົວທີ່ປູກຢູ່ໃນເຂດ Kostroma, Moscow, Kaluga ແລະໃນຫນຶ່ງໃບຫມາກເລັ່ນຈາກເມືອງ Yeisk ຂອງອານາເຂດ Krasnodar (ຕາຕະລາງ 4, 5).
ຕາຕະລາງ 4. ການກວດຫາໂຄກໂຄ້ດ Colletotrichum ໃນຫົວມັນຕົ້ນ*
ຕົວເລກຕົວຢ່າງ | ແນວພັນມັນຕົ້ນ | ສະຖານທີ່ການຂະຫຍາຍຕົວ | ການກວດຫາ C. coccodes | ຮອບວຽນ |
---|---|---|---|---|
1 | ສີແດງ | ພາກພື້ນ Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | ພາກພື້ນ Moscow | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky ຕົ້ນ | ພາກພື້ນ Moscow | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | ພາກພື້ນ Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | ປັນ | ພາກພື້ນ Kaluga | - | |
15 | Gala | ເຂດ Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
ຫມາຍເຫດ. * ຈໍານວນ DNA ໃນຕົວຢ່າງທັງຫມົດແມ່ນ 50 ng.
ຕາຕະລາງ 5. ການກວດຫາໂຄລໂຕທຣິກຄິມ ໂຄໂຄໂຄດ ເທິງໃບໝາກເລັ່ນ*
ຕົວເລກຕົວຢ່າງ | ສະຖານທີ່ການຂະຫຍາຍຕົວ | ການກວດຫາ C. coccodes | ຮອບວຽນ |
---|---|---|---|
1 | ເຂດ Krasnodar, ເມືອງ Crimea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | ເຂດ Krasnodar, ເມືອງ Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* ຈໍານວນ DNA ໃນຕົວຢ່າງທັງຫມົດແມ່ນ 50 ng.
ລະບົບການທົດສອບທີ່ພວກເຮົາສ້າງບໍ່ຕ່ໍາກວ່າທີ່ພັດທະນາໂດຍນັກຄົ້ນຄວ້າອັງກິດ (Cullen et al., 2002) ໃນຄວາມອ່ອນໄຫວແລະຄວາມສະເພາະແລະເຫມາະສົມສໍາລັບການວິເຄາະຕົວຢ່າງພືດ. ການນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະຫົວຂອງເມັດໄດ້ເຮັດໃຫ້ມັນເປັນໄປໄດ້ໃນການກວດພົບ C. coccodes DNA ໃນຫົວໂດຍບໍ່ມີອາການຂອງຄວາມເສຍຫາຍພາຍນອກແລະສົບຜົນສໍາເລັດການວິເຄາະການຕິດເຊື້ອຂອງໃບ.
ໃນລັດເຊຍ, ມາຮອດປະຈຸບັນ, ຫົວມັນຕົ້ນຍັງບໍ່ໄດ້ຮັບການວິເຄາະສໍາລັບການຕິດເຊື້ອ C. coccodes. ການສຶກສາຄັ້ງທໍາອິດຂອງພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໃນ 16 ຫົວທີ່ໄດ້ຮັບການທົດສອບທີ່ປູກຢູ່ໃນເຂດຕ່າງໆຂອງສະຫະພັນລັດເຊຍ, 5 ມີ C. coccodes. ນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸດສີດໍາຂອງຫົວມັນຕົ້ນແມ່ນພະຍາດມັນຕົ້ນທີ່ພົບເລື້ອຍໃນລັດເຊຍ, ແລະບົດບາດຂອງມັນໃນການຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານແລະຄຸນນະພາບຂອງພືດມັນຕົ້ນແມ່ນຕໍ່າກວ່າ.
ໃນເວລາທີ່ວິເຄາະໃບຫມາກເລັ່ນ, ການມີທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຂອງ C. coccodes DNA ໄດ້ຖືກກວດພົບຢູ່ໃນຫນຶ່ງໃບຈາກເມືອງ Yeisk ຂອງອານາເຂດ Krasnodar. ໃນເມື່ອກ່ອນ, ເມື່ອກວດເບິ່ງສວນຫມາກເລັ່ນໃນພາກໃຕ້ຂອງລັດເຊຍໂດຍໃຊ້ລະບົບການທົດສອບຂອງອັງກິດ (Cullen et al., 2002), ໃບທີ່ມີ C. coccodes ໄດ້ຖືກລະບຸ, ແລະໃນບາງທົ່ງນາມີອັດຕາສ່ວນສູງຂອງໃບທີ່ຖືກກະທົບໂດຍ C. coccodes (Belov et al., 2018). ໃນອານາເຂດຂອງ Krasnodar ແລະ Primorsky ແລະພາກພື້ນ Moscow, ພວກເຮົາໄດ້ຄົ້ນພົບຫມາກໄມ້ຫມາກເລັ່ນ, ເຊິ່ງພວກເຮົາສາມາດແຍກອອກຈາກວັດທະນະທໍາອັນບໍລິສຸດຂອງ C. coccodes. ມັນເປັນໄປໄດ້ວ່າ C. coccodes ແມ່ນແຜ່ຫຼາຍຢູ່ໃນຫມາກເລັ່ນໃນລັດເຊຍຫຼາຍກ່ວາທີ່ເຊື່ອໃນປັດຈຸບັນ, ແລະອັນຕະລາຍຂອງມັນຍັງຖືກຄາດຄະເນໄວ້ຫນ້ອຍລົງ.
ດັ່ງນັ້ນ, ມາຮອດປະຈຸບັນ, ຂໍ້ມູນພຽງພໍໄດ້ສະສົມກ່ຽວກັບການແຜ່ກະຈາຍຂອງ C. coccodes ຢ່າງກວ້າງຂວາງກ່ຽວກັບມັນຕົ້ນແລະຫມາກເລັ່ນ.
ເພື່ອໃຫ້ເຂົ້າໃຈໄດ້ດີຂຶ້ນກ່ຽວກັບບົດບາດຂອງເຊື້ອເຫັດນີ້ໃນການພັດທະນາພະຍາດຂອງມັນຕົ້ນແລະຫມາກເລັ່ນ, ການຕິດຕາມຢ່າງກວ້າງຂວາງກ່ຽວກັບອັດຕາການແຜ່ກະຈາຍຂອງມັນຢູ່ໃນລັດເຊຍ, ການສຶກສາບົດບາດຂອງການຕິດເຊື້ອຂອງດິນແລະເມັດ, ແລະບົດບາດຂອງຈຸດສີດໍາໃນການສູນເສຍການເກັບຮັກສາແມ່ນມີຄວາມຈໍາເປັນ. ການນໍາໃຊ້ການວິນິດໄສ PCR ສາມາດສ້າງຄວາມສະດວກໃນການເຮັດວຽກນີ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ແລະການນໍາໃຊ້ພ້ອມກັນຂອງທັງສອງລະບົບການທົດສອບຈະຊ່ວຍເພີ່ມຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງການວິເຄາະຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.
ວຽກງານດັ່ງກ່າວໄດ້ຮັບການສະຫນັບສະຫນູນຈາກການຊ່ວຍເຫຼືອລ້າຂອງມູນນິທິວິທະຍາສາດລັດເຊຍ ເລກທີ 18-76-00009.
ບົດຄວາມດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກຕີພິມໃນວາລະສານ “Mycology ແລະ Phytopathology” (ສະບັບທີ 54, ສະບັບເລກທີ 1, 2020).